Interdisziplinäre Doktorandenprojekte 2019

Biobasierte Inhaltsstoffe werden gegenwärtig als Alternative für petrochemische Substrate in vielen Industrieprodukten gehandelt, z.B. Biotenside oder bioaktive Alkaloide beispielsweise für potentielle Anwendungen in Agrochemikalien. Die rekombinante Herstellung solcher hochwertigen Verbindungen durch etablierte mikrobielle Produktionsstämme wie Pseudomonas putida KT2440, dass in den BioSC FocusLabs Bio² und CombiCom zur Anwendung kommt, ist eine Strategie, um Zugang zu diesen hochwertigen Naturstoffen zu erhalten. Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche rekombinante Produktionsstrategie sind, neben der Sicherstellung einer robusten Expression der Biosynthesegene, Strategien zur optimalen Prozesskontrolle und das Verständnis der physiologischen Auswirkungen der hergestellten Verbindungen auf die Wirtszellen. 
Das Ziel von ResPuTra war die Aufklärung bislang nicht bekannter Reaktionen eines genetisch optimierten P. putida-Chassis auf die Produktion von Naturstoffen mit potentiell nachteiligen Auswirkungen für die Zelle durch Sequenzierung vollständiger Transkriptome (RNA-Seq), um Angriffspunkte für die Optimierung von Produktionsstämmen und -prozessen abzuleiten. Als Beispiel wurde die Reaktion der Zellen auf die Produktion von potentiell membranschädigenden Rhamnolipid-Biotensiden (ein Zielmolekül von Bio2) unter Verwendung eines Salicylat-induzierbaren Expressionssystems untersucht.  Eine bemerkenswert starke Reaktion war bereits bei Exposition von P. putida KT2440 GR18 mit Salicylat zu beobachten. Insbesondere mit der Eisenhomeostase assoziierte Gene wurden hochreguliert, vermutlich aufgrund eines erhöhten Eisenbedarfs im Siderophor-defizienten Stammhintergrund zur Detoxifikation der Aromaten. Die massive Transkriptomveränderung einschließlich der Hochregulierung vieler Transkriptionsfaktoren und Transportproteine deutet jedoch auch auf einen starken Stress während der Salicylatexposition hin. 
Die Produktion von Rhamnolipiden führte insbesondere zur Hochregulierung mutmaßlicher Gene für unspezifische Exportproteine. Diese stellen damit interessante Ansatzpunkte für zukünftige Studien zur Sekretion von Rhamnolipiden und der Toleranz von P. putida in diesem Zusammenhang dar, letztendlich darauf abzielend, einen Stamm mit verbesserter Rhamnolipid-Sekretion zu konstruieren. Promotoren, die auf Rhamnolipide ansprechen, könnten auch als Grundlage für Biosensoren zur nichtinvasiven Echtzeitüberwachung der Produktbildung dienen. Die starke Salicylatantwort erschwerte hier die eindeutige Identifizierung von rhamnolipidspezifschen Reaktionen, trotzdem konnte jedoch ein Satz von Kandidatengenen zusammengestellt werden. 
Zusammenfassend konnten im Projekt ResPuTra potenzielle Ansatzpunkte für eine Expressionsoptimierung von Zielgenen mittels Salicylat-induzierbarer Systemen, im Speziellen zur Optimierung der Rhamnolipidproduktion ermittelt werden. Weiterhin ergaben sich Ansatzpunkte für die weitere Stammentwicklung im Hinblick auf eine effizientere Sekretion von Rhamnolipiden. Biosensoren können mit bereits konstruierten Vektoren optimiert oder neu konstruiert werden. 

Publikation

Gauthier, C, Lavoie, S, Kubicki, S, Piochon, M, Cloutier, M, Dagenais-Roy, M, Groleau, M-C, Pichette, A, Thies, S and Déziel, E (2024). Structural characterization of a nonionic rhamnolipid from Burkholderia lata. Carbohydrate Research 535: 108991.  

Die Co-Kultivierung von Mikroorganismen mit unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften kann eine Vielzahl von Vorteilen für die industrielle Biotechnologie bieten. Innerhalb eines synthetischen mikrobiellen Konsortiums sind jedoch die Kontrolle des Zellwachstums sowie der Zielgenexpression nötig, wozu zunächst eine präzise Messung dieser Parameter erforderlich ist. Daher sollte im Rahmen des Projekts SynCom eine Co-Kultivierungs-Plattform für synthetische mikrobielle Konsortien etabliert werden, die die online-Messung der Biomasse und Zielgenexpression verschiedener Pseudomonas putida KT2440 Stämme ermöglicht.  
Zu diesem Zweck wurden drei Fluoreszenzproteine mit unterscheidbaren Emissionsspektren ausgewählt und im Anschluss drei P. putida-Stämme erzeugt, welche diese unterschiedlichen Fluoreszenzreporter produzieren. Dazu erfolgte eine Ligase-unabhängige Konstruktion der integrativen Vektoren sowie die stabile Integration verschiedener Fluoreszenzreporter Gene an unterschiedlichen chromosomalen Positionen im P. putida Genom. Im Anschluss wurden die erstellten Stammbibliotheken analysiert und hinsichtlich ihres jeweiligen Wachstumsverhaltens und der Fluoreszenzsignal-Intensität sortiert, um Stämme mit stabiler und konstanter Expression auszuwählen.  
Die Messung der Fluoreszenzintensität und Zelldichte der einzelnen Stämme zeigte eine Korrelation der Signale, was eine mögliche Nutzbarkeit der Fluoreszenz als Indikator für Biomasse in Aussicht stellt. Ein selbst gebauter BioLector mit frei einstellbaren Wellenlängenkombinationen wurde verwendet, um die optimalen Anregungs- und Emissionswellenlängen für jeden Stamm zu bestimmen, so dass eine maximale Sensitivität und Selektivität der Messung erreicht wurde (Abbildung 1). Anschließend wurden alle drei Stämme in Co-Kultur untersucht. Es zeigte sich, dass das Wachstum jedes Stammes innerhalb der Co-Kultur individuell anhand des spezifischen Fluoreszenz-Signals verfolgt werden konnte.  
In diesem Projekt gelang es, einen experimentellen Aufbau zu etablieren, mit dem Einblicke in das Wachstumsverhalten des biotechnologisch relevanten Bakteriums P. putida KT2440 in einer synthetischen Co-Kultivierung gewonnen werden können. 

Das ProdAnchor-Miniprojekt - eine Kooperation der BioSC FocusLabs greenRelease und CombiCom – hatte die Etablierung einer innovativen Aufreinigungsmethode für die membrangebundene Prodigiosinsynthetase PigC aus Bakterienkulturen zum Ziel. Die Grundidee bestand dabei in der Immobilisierung von PigC auf Polymeroberflächen mithilfe von Ankerpeptiden, die endständig an PigC angehängt wurden. Die Prodigiosinsynthetase PigC, ein Schlüsselenzym für die Produktion von bioaktiven Naturstoffen in CombiCom, katalysiert den letzten Schritt des Biosynthesewegs von Prodigiosin, einem roten wasserunlöslichen Pigment mit vielversprechenden Wirkungsspektren wie z. B. Antikrebs- und Antibiotikaeffekte. Da PigC in die bakterielle Membran integriert ist, ist die Isolierung von reinem und aktivem PigC schwierig. In ProdAnchor wurden PigC Ankerpeptide aus verschiedenen Organismen angehängt (Bacillus subtilis, Langschwanz-Makaken und Japanischen Pfeilschwanzkrebsen), die alle an Kunststoffpolymere binden können. Alle PigC-Ankerpeptid-Fusionskonstrukte zeigten in Expressionskulturen volle katalytische PigC-Aktivität. Nach Immobilisierung der Konstrukte an Wänden von hydrophoben Gefäßen konnte PigC-Aktivität durch die typische Rotfärbung nach Zugabe der Substratlösung beobachtet werden. Zur Optimierung von Immobilisierung, Waschen und Elution wurde eine säulenchromatographische Methode mit verschiedenen Polymermaterialien getestet, die jedoch bislang noch keine zufriedenstellende PigC-Reinheit in der aktiven Elutionsfraktion ergab. 
Insgesamt konnte in ProdAnchor gezeigt werden, dass kleine Peptide als hydrophobe Anker an PigC angehängt werden können, ohne die katalytische Aktivität von PigC zu beeinträchtigen. Ein Detergenz-Screening ergab den optimalen Elutionspuffer für PigC. In säulenchromatographischer PigC-Aufreinigung war jedoch bislang das Verhältnis von Oberfläche zu Protein unzureichend, sodass künftige Arbeiten zur Feinabstimmung der Aufreinigungsbedingungen erforderlich sind. 

Ziel des MELOBEE-Projekts war die Herstellung von Mannosylerythritollipiden (MEL) aus mikrobiellem Öl (sog. „Single Cell Oil“, SCO), das durch Fermentation von Zuckerrübenschnitzeln (ZRS) gewonnen werden sollte. MEL sind hochwertige Glycolipide mit potenziellen Anwendungen im medizinischen und kosmetischen Bereich. Bisher ist die Produktion von MEL wirtschaftlich nicht tragbar, ein Grund dafür sind hohe Kosten von Pflanzenölen, die in der konventionellen MEL-Produktion als Substrat eingesetzt werden. Im Unterschied dazu hat SCO den Vorteil, dass es nachhaltig aus erneuerbaren Rohstoffen und Abfallströmen hergestellt werden kann. Dies wurde am Beispiel von Zuckerrübenschnitzeln (ZRS) gezeigt, die einen kostengünstigen Nebenstrom der Zuckerindustrie darstellen.

      Die Ölhefe Cryptococcus curvatus wurde erfolgreich in einem 2 L Laborfermenter kultiviert, wobei 100 g/L ZRS als Substrat eingesetzt wurden. Nach 7 Tagen Kultivierung wurden die Zellen geerntet und gefriergetrocknet, woraufhin etwa 60 g eines trockenen Pulvers erhalten wurden, das die lipidhaltigen Zellkörper enthielt.

      Zur Extraktion des SCO wurde eine Extraktion mit überkritischem CO₂ durchgeführt, um die Wirtschaftlichkeit des andernfalls kostspieligen Isolationsprozesses zu verbessern. Hierbei wurde reines SCO in einer Ausbeute von etwa 10% (w/w) erhalten, dessen Konsistenz und Geruch an Raps- oder Sonnenblumenöl erinnerten.

Das aufgereinigte SCO wurde anschließend als Substrat für eine Fermentation mit dem hefeartigen Pilz Pseudozyma aphidis verwendet, einem etablierten MEL-Produktionsstamm. Die Eignung von SCO als Substrat zur MEL-Produktion wurde in Schüttelkolbenexperimenten untersucht und mit der von Sonnenblumen- und Sojaöl, sowie mit Glucose verglichen. Die Produktion von MEL wurde mittels Dünnschichtchromatografie (DC) nachgewiesen.

Es konnte gezeigt werden, dass SCO grundsätzlich als Substrat für die MEL-Produktion geeignet ist, jedoch geringere Ausbeuten ergab als Sonnenblumen- oder Sojaöl. Während das Trockengewicht von Ethylacetat-Extrakten für SCO einen hohen Gehalt von ca. 27 g/L extrahierbarer Komponenten ergab, zeigte die DC-Analyse lediglich eine schwache MEL-Bande, was darauf hindeutet, dass der Großteil des extrahierten Materials aus anderen Komponenten bestand. Sonnenblumen- und Sojaöl ergaben jeweils 8 und 6 g/L extrahierbarer Komponenten, von denen der überwiegende Teil MEL waren. Mit Glucose, was Literaturberichte unterstützt, wurden keine MEL gebildet. Dies unterstreicht die Notwendigkeit zur Verwendung von Ölen für die effiziente Produktion von Glycolipiden mit P. aphidis.

Es lässt sich zusammenfassen, dass der Ansatz zur Verwendung von SCO statt Pflanzenölen für die Produktion von MEL vielversprechend erscheint, obwohl die erreichten Titer und Ausbeuten unter denen lagen, die mit Sonnenblumen- oder Sojaöl erreicht wurden. Da die Wirtschaftlichkeit der konventionellen MEL-Produktion jedoch insbesondere durch hohe Substratkosten negativ beeinflusst wird, könnte die Substitution der klassischerweise verwendeten Öle durch SCO aus nachhaltigen Quellen für die Entwicklung eines wirtschaftlich tragbaren MEL-Produktionsprozesses relevant sein.