Interdisziplinäre Doktorandenprojekte 2021/22

Natürliche Indolcarbazole sind eine wertvolle Quelle für außergewöhnliche bioaktive Verbindungen mit zahlreichen potenziellen Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie. Jede Verbindung kann ihre eigenen vielversprechenden bioaktiven Eigenschaften besitzen. Eine maßgeschneiderte Modifizierung ihrer chemischen Struktur hat sich als wirksames Instrument zur Weiterentwicklung der Bioaktivität erwiesen. Im Rahmen des ARcyria-Projekts wurden (Halo-)Pseudomonas-Plattformen für die biosynthetische Produktion solcher Arcyriaflavine geschaffen. Zur Modifikation ihrer Strukturen wurden geeignete halogenierende oder hydroxylierende Enzyme identifiziert und ein Arcyriaflavin A-Biosynthesecluster um den jeweiligen enzymatischen Schritt erweitert. Neben der Erweiterung des Stoffwechsels konnte in Pseudomonas putida KT2440 eine Produktionssteigerung durch Bioprozessoptimierung erreicht werden. Unter Verwendung der optimierten Prozessparameter wurde eine neue Produktionsplattform mit dem bisher unbeschriebenen Halopseudomonas litoralis-Stamm für die Arcyriaflavin-Synthese eingesetzt. Interessanterweise verstoffwechselte dieser Stamm das zugeführte Vorprodukt L-Tryptophan über andere Biosynthesewege fast vollständig. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer detaillierteren Bioprozessentwicklung durch Untersuchung des Kohlenstoffflusses, wodurch zusätzlich eine Grundlage für weitere biotechnologische Anwendungen geschaffen wird.

Inositole (Cyclohexan-1,2,3,4,5,6-hexole) sind in allen Bereichen des Lebens weit verbreitet, wo sie an vielen zellulären Prozessen und regulatorischen Netzwerken beteiligt sind. Neben ihrer physiologischen Funktion werden den Isomeren myo-, scyllo- und D-chiro-Inositol verschiedene gesundheitsfördernde und heilende Eigenschaften zugeschrieben, die in vielen Studien, z. B. zu Diabetes und Alzheimer, untersucht wurden. Viele Mikroorganismen verfügen über einen komplexen Inositol-Stoffwechsel, bei dem unterschiedliche Inositol-Isomere ineinander umgewandelt werden. Diese Enzyme sind eine vielversprechende Quelle für die Entwicklung nachhaltiger, biotechnologischer Prozesse zur Erzeugung verschiedener Inositole. Wir haben sieben Enzyme, so genannte Inositol-Dehydrogenasen (IDHs), in Corynebacterium glutamicum identifiziert, die hauptsächlich für die Umwandlung von Inositol verantwortlich sind. Mit Hilfe gentechnisch veränderter C. glutamicum-Stämme haben wir ermittelt, welches Inositol-Isomer von welcher IDH akzeptiert wird. Wir haben Strukturmodelle der IDHs erstellt, um ein Enzym-Substrat-Docking durchzuführen und so die Enzym-Inositol-Interaktion zu untersuchen und potenzielle Bindungsmodi der Inositole innerhalb der Bindungstasche der verschiedenen IDHs zu identifizieren.

Unsere Arbeit bietet neue Einblicke in die biochemischen Eigenschaften der IDHs, was eine Voraussetzung für die Entwicklung geeigneter Synthesewege und effizienter mikrobieller Wirte ist. Dieses Wissen schafft die Grundlage für das rationale Design der IDHs und ermöglicht so den Zugang zu neuen Synthesewegen für die biotechnologische Umwandlung von Inositol-Isomeren.

Publikationen

Ramp, P, Pfleger, C, Dittrich, J, Mack, C, Gohlke, H and Bott, M (2022). Physiological, Biochemical, and Structural Bioinformatic Analysis of the Multiple Inositol Dehydrogenases from Corynebacterium glutamicum. Microbiol Spectr 10(5): e0195022.

Ziel dieses Projekts war die Charakterisierung der Aufnahme und Verwertung von Saccharose durch das Pilz-Biotech-Chassis Ustilago maydis, um in Zukunft eine Co-Kultur zwischen U. maydis und Cyanobakterien zu ermöglichen. Eine Co-Kultur aus Cyanobakterien, die aus Sonnenlicht Zucker erzeugen, und Mikroben, die sich von diesem Zucker ernähren, um wertvolle Verbindungen wie Sesquiterpene zu produzieren, ist eine hervorragende Alternative zur Verwendung von reinem Zucker als Substrat, da die Produktionskosten gesenkt werden und der aus Pflanzen gewonnene Zucker  statt dessen als Lebensmittel verwendet werden kann. Dieser Ansatz birgt jedoch die Herausforderung, dass die Saccharose-Produktion bisher zur Verfügung stehender Cyanobakterienstämme sehr gering ist. Um dieses Problem zu lösen, haben wir einen zweistufigen Prozess verfolgt: Zunächst wurden zur Optimierung des Pilzwachstums bei niedrigen Saccharosekonzentrationen entscheidende Gene für den Saccharosestoffwechsel in U. maydis-Stämmen, die Lycopin produzieren, genetisch hochreguliert. Lycopin zeigt eine stark rote Farbe und dient als Indikator für den Gehalt an FPP, einem wichtigen Zwischenprodukt für die Sesquiterpenproduktion. Gleichzeitig wurde ein membranbasiertes Fed-Batch-System angepasst und optimiert, um U. maydis künstlich mit niedrigen Saccharosekonzentrationen zu versorgen. Dieses System wurde angewendet, um die erhaltenen Stämme mit dem Vorläufer zu vergleichen und sie hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Verwertung von Saccharose zu charakterisieren. Wir fanden heraus, dass alle Stämme in der Lage waren, im Fed-Batch-System zu wachsen, und dass die Lycopinakkumulation sowohl im Batch- als auch im Fed-Batch-System vollständig intakt war. Darüber hinaus zeigte ein optimierter Stamm mit konstitutiver Invertase-Produktion einen erhöhten Saccharose-Umsatz in enzymatischen Assays. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein mathematisches Modell für das Wachstum von U. maydis auf Saccharose im Fed-Batch-Verfahren erstellt, das in Zukunft einen fundierten Ansatz für eine Co-Kultur mit Cyanobakterien ermöglicht.