BOOST FUND Projekt CatIBs

Catalytically active inclusion bodies: New carrier-free enzyme immobilisates for biocatalysis

Ergebnisse

Katalytisch-aktive inclusion bodies (KatIBs) sind neuartige, biologisch-herstellbare Enzymimmobilisate, welche in der synthetischen Chemie und der industriellen Biotechnologie breite Anwendung finden könnten. Aufgrund ihrer einfachen und preiswerten Produktion tragen KatIB-basierte Enzymimmobilisate sowie die entsprechenden Technologien zum nachhaltigen Ressourcenmanagement bei. Das Verfahren beruht auf der molekularbiologischen Fusion einer sog. coiled-coil Domäne an ein Zielprotein. Die Expression der entsprechenden Genfusion in Escherichia coli resultiert hierbei in der Bildung großer Mengen KatIBs. Ziel des BOOST FUND Projektes CatIBs war es eine generische Strategie zur Produktion von KatIBs zu entwickeln und zu optimieren. Dies sollte erreicht werden indem i) das Repertoire der als KatIBs verfügbaren Enzyme/Proteine erweitert wird (Partner IMET, HHU), ii) bestehende Produktionsmethoden evaluiert und optimiert werden (Partner AVT, RWTH), und iii) ihr Potenzial für den Einsatz in der Biokatalyse evaluiert wird (Partner IBG-1, FZJ). Während des Förderzeitraumes konnte die Anwendbarkeit des KatIB-Prinzips für sechs weitere Proteine und Enzyme unterschiedlicher Komplexität nachgewiesen werden. Insgesamt konnte KatIB-Bildung somit für 10 verschiedene Zielproteine erfolgreich demonstriert werden. Koexpressions- und Kolokalisationsstudien ergaben, dass zwei Proteine/Enzyme innerhalb von KatIB-Partikeln kolokalisiert werden können, was die Realisierung von Reaktionskaskaden ermöglicht und die Ressourcenökonomie der jeweiligen Prozesse weiter verbessert. Die Induktions- bzw. Wachstumstemperatur KatIB-produzierender Zellen wurde als entscheidender Parameter für die erfolgreiche Bildung von KatIBs identifiziert. Wobei offenbar niedrige Induktionstemperaturen erforderlich sind, um die Produktion von inclusion body (IB) Partikeln mit (katalytischer) Aktivität (CatIBs) zu ermöglichen. Um die entsprechenden Untersuchungen durchführen zu können, wurde ein System entwickelt, welches es erlaubt einen definierten Temperaturgradienten in 48-well Flowerplates anzulegen, und so Kulturen parallel bei verschieden Temperaturen zu kultivieren und deren Wachstum und Eigenschaften (Produktbildung, Fluoreszenz) online zu überwachen. Darüber hinaus wurde ein generisches Protokoll für die Herstellung von KatIBs etabliert, welches eine routinemäßige Produktion von bis zu 10 g KatIBs aus 100 g (nassen) E. coli Zellen ermöglicht. Um die biotechnologische Anwendbarkeit von KatIBs auszuloten, wurden diese in verschiedenen Enzymreaktoren (Enzym-Membranreaktor, Plug-Flow-Reaktor) getestet. Hierbei konnte für KatIBs, im Vergleich zu entsprechenden löslichen Enzympräparaten, eine erhöhte Stabilität nachgewiesen werden. KatIBs der Lysindecarboxylase aus E. coli (EcLDC) wurden für die Herstellung von Cadaverin (1,5-Diaminopentan) in zellfreien Kulturüberständen eines Corynebacterium glutamicum L-Lysin-Produzenten unter Verwendung technisch relevanter Reaktionsbedingungen eingesetzt. Hierbei wurden hohe Produkttiter und Raumzeitausbeuten erzielt, was den KatIB-basierten Prozess mit dem derzeit besten in der Literatur beschriebenen fermentativen Prozess konkurrenzfähig macht.

Beteiligte Core Groups

Koordinator
Dr. Ulrich Krauss
Institut für Molekulare Enzymtechnologie,
Heinrich-Heine-University Düsseldorf
Forschungszentrum Jülich
Tel.: +49 2461-61-2939
Fax.: +49 2461-61-2490
email: u.krauss@fz-juelich.de

Partner
Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger, Dr. Ulrich Krauss, Institute of Molecular Enzyme Technology (IMET), Heinrich-Heine-University Düsseldorf and IBG-1: Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich
Prof. Dr. Jochen Büchs, AVT-Biochemical Engineering, RWTH Aachen University
Prof. Dr. Wolfgang Wiechert, Prof. Dr. Martina Pohl, IBG-1: Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich

Projektlaufzeit
01.01.2015 – 31.12.2017

Förderung
CatIBs ist Teil des NRW-Strategieprojektes BioSC, das durch das Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Bundeslandes NRW gefördert wird.

Publications

Krauss, U, Jager, VD, Diener, M, Pohl, M and Jaeger, KE (2017). Catalytically-active inclusion bodies-Carrier-free protein immobilizates for application in biotechnology and biomedicine. J Biotechnol 258: 136-147.

Diener, M, Kopka, B, Pohl, M, Jaeger, K-E and Krauss, U (2016). Fusion of a coiled-coil domain facilitates the high-level production of catalytically active enzyme inclusion bodies. ChemCatChem 8(1): 142-152.