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Ustilago maydis als Biotensidproduzent

Der eukaryotische Mikroorganismus Ustilago maydis ist ein natürlicher Produzent zweier Biotenside, dem Cellobioselipid Ustilaginsäure und den Mannosylerythritol Lipiden (MEL). In der Natur werden die beiden Glykolipide als Gemisch natürlicher Varianten unter Stickstoffmangelbedingungen produziert. Im Fall der MEL existieren vier Formen, MEL-A bis MEL-D. Diese Varianten unterscheiden sich im Grad der Acetylierung, wobei es sich bei MEL‑D um eine vollständig deacetylierte Form handelt. Der zugrundeliegende Biosyntheseweg ist bekannt (Abb. 1) und die entsprechenden Enzyme sind auf Genomebene in einem Gencluster aus fünf Enzymen organisiert.

Abb. 1: Biosyntheseweg von MEL in Ustilago maydis (Müntjes et al., 2020)[1].

Im Rahmen des FocusLab Bio2 sollten Prozesse etabliert werden, die es ermöglichen, MEL basierend auf nachhaltigen Rohstoffen zu produzieren. Eine neue synthetische Regulation des Genclusters sollte dabei die Abhängigkeit der MEL Produktion vom starken Stickstoffmangel reduzieren, um die konstitutive Produktion von MEL auf Basis Pektin-reicher Seitenströme aus der Zuckerindustrie zu gewährleisten. Aufgrund ihrer weitreichenden Expertise für das genetische Engineering von U. maydis befasste sich die Core Group (CG) Feldbrügge mit diesem Ansatz. Für die neue synthetische Regulation des MEL Genclusters wurde von der Gruppe eine 2A Peptidstrategie angewendet. Hier wurden Gene des Clusters, die in Eukaryoten normalerweise getrennt voneinander reguliert und transkribiert werden, unter die Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors gestellt und gemeinsam exprimiert, was zu einer Art „polycistronischer mRNA“ führt. Es konnte gezeigt werden, dass im Zuge der Translation aus dieser mRNA separate Proteine gebildet werden. Auf diese Weise konnten erfolgreich drei Clustergene künstlich co-reguliert werden, was selbst bei vorhandenem Stickstoff im Medium zur Produktion eines veränderten MEL-Variantenmusters führte.

Für die Produktion von MEL auf Pektin-reichen Seitenströmen wurden die im SeedFund UstiLyse und im BoostFund PectiLyse begonnenen Arbeiten fortgeführt. In den Vorläuferprojekten wurde von der CG Feldbrügge bereits erfolgreich eine genetische Strategie etabliert, bei der hydrolytische Enzyme in der Hefeform des Pilzes aktiviert werden können. Die Strategie wurde erweitert, indem das Enzymrepertoire des Pilzes mit Hilfe potenter heterologer pektinolytischer Enzyme komplementiert und verbessert wurde. Die Möglichkeit, einen kürzlich in U. maydis beschriebenen unkonventionellen Sekretionsweg für den Export von bakteriellen Enzymen zu nutzen, stellte dabei ein Alleinstellungsmerkmal dar.

Die enge Zusammenarbeit von Mikrobiologen/innen und Bioverfahrenstechnikern/innen erschloss völlig neue Möglichkeiten der Stammcharakterisierung und -optimierung mittels Online-Analytik. Für die Erfassung des Kultivierungsverlaufs von Stämmen, die hydrolytische Enzyme sekretierten, wurde von der CG Büchs die RAMOS (respiration activity monitoring system) Anlage eingesetzt (Abb. 2). Mit der RAMOS Technik kann kontinuierlich der Sauerstoff- und Kohlenstoffdioxidtransfer von acht parallel kultivierten Ansätzen bestimmt werden. Dies ermöglichte nicht nur prognostische Aussagen zum Stoffwechsel der U. maydis Stämme auf verschiedenen Substraten, wie beispielsweise Glucose, Xylose und Arabinose, sondern auch die Berechnung von Enzymaktivitäten und Substratumsatz.

Abb. 2: Respiration Activity Monitoring System. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen.

Um das Substratspektrum von U. maydis zu erweitern und den Abbau des Hauptbestandteils von Pektin, Polygalakturonsäure, zu ermöglichen, wurden Stämme getestet, die verschiedene Kombinationen von Endo- und Exopolygalakturonasen sekretieren (Abb. 3). Auf diese Weise konnte das Wachstum von U. maydis auf Polygalakturonsäure etabliert werden. Die Kombination zweier heterologer Enzyme aus anderen Pilzen erwies sich dabei als am besten geeignet. Die RAMOS Technologie unterstützte die Stammcharakterisierung durch Etablierung einer indirekten, non-invasiven Bestimmung der Restsubstratkonzentration der Polygalakturonsäure anhand der Gesamtsauerstofftransferrate. Anschließend wurden Mischkulturen der Überexpressionsstämme mit der RAMOS Technologie in unterschiedlichen Animpfverhältnissen kultiviert und somit das optimale Verhältnis der Stämme für den Abbau der Polygalakturonsäure ermittelt (Abb. 4). Hierbei zeigte sich, dass ein höheres Verhältnis des Exopolygalacturonase überexprimierenden U. maydis Stammes zum schnellsten Abbau der Polygalacturonsäure führe (Abb. 4 C).

Abb. 3: Zusammenspiel von Endo- und Exopolygalakturonasen beim Abbau von Polygalakturonsäure (Stoffels & Müller et al., 2020)2.
Abb. 4: Co-Kultivierung von U. maydis Stämmen auf Polygalakturonsäure mit variierenden Animpfverhältnissen. Die verwendeten Stämme U. maydis AB33P5ΔR/AtPgaX und AB33P5ΔR/AaPgu[1] überexprimieren eine fungale exo-Polygalakturonase bzw. eine fungale endo-Polygalakturonase. Medium: Modifiziertes Verduyn-Mineralmedium, mit Glucose (4 g/L) und Polygalakturonsäure (20 g/L, Reinheit 85 %) als Kohlenstoffquellen. (Stoffels & Müller et al., 2020)[2].

Die im Verlauf des FocusLabs Bio2 erzielten Ergebnisse stellen eine erste, essenzielle Stufe zur Nutzung von Pektin-reichen Seitenströmen aus der Zuckerindustrie für die Produktion von Biotensiden in U. maydis dar.

 

[1] Reprinted as a part of figure 5 from Frontiers in Microbiology, 11 /1384, Müntjes, K.,
Philipp, M., Hüsemann, L., Heucken, N., Weidtkamp-Peters, S., Schipper, K., Zurbriggen, MD., Feldbrügge, M. Establishing Polycistronic Expression in the Model Microorganism Ustilago maydis. Copyright (2020).
[2] Reprinted from Journal of Biotechnology, 10 /307, Stoffels P., Müller MJ., Stachurski S., Terfrüchte M., Schröder S., Ihling N., Wierckx N., Feldbrügge M., Schipper K., Büchs J., Complementing the intrinsic repertoire of Ustilago maydis for degradation of the pectin backbone polygalacturonic acid, 148-163, Copyright (2020), with permission from Elsevier.

 

Beteiligte Core Groups

Prof. Michael Feldbrügge
Dr. Kerstin Schipper
Dr. Silke Jankowski
Magnus Philipp
Institute for Microbiology
Heinrich-Heine University Düsseldorf

Prof. Jochen Büchs
Dr. Nina Ihling
Maximilian Schelden
Chair of Biochemical Engineering
RWTH Aachen University