Ergebnisse

Unter den Naturstoffen finden sich eine Vielzahl bioaktiver Verbindungen, die für vielfältige Anwendungen relevant sein können, etwa in der Agrarwirtschaft oder im medizinischen Bereich. Da die chemische Totalsynthese häufig sehr aufwändig ist, kann die Produktion in einem rekombinanten Mikroorganismus den Zugang zu solchen Verbindungen – und auch zu Derivaten davon – verbessern. Das VIOLA Projekt hat die Produktion von Indol-Alkaloiden, nämlich (Deoxy)violacein, im Bakterium Pseudomonas putida KT2440 etabliert. Die Violacein-Bisindole sind insofern von besonderem Interesse, als dass sie verschiedene relevante Bioaktivitäten aufweisen, unter anderem die Inhibierung von pflanzenpathogenen Pilzen wie Phytophthora, Fusarium oder Botrytis, die verheerende Schäden verursachen können. Daher wurde die entsprechende Biosynthese in P. putida durch genomische Integration von Genen aus Chromobacterium violaceum in die rDNA etabliert. Der intrinsische Metabolismus von P. putida lieferte das Substrat L-Tryptophan, welches erfolgreich in einer mehrschrittigen Katalyse zum Produkt umgesetzt wurde. Mittels eines robotic workflow für die Kultivierung, die Probenentnahme sowie at-line Analysen, wurden verschiedene Kultivierungsbedingungen evaluiert. Dadurch konnte der Produktions-Prozess hinsichtlich einer effektiven Umsetzung von L-Tryptophan zu Deoxyviolacein optimiert werden. Außerdem wurden Protokolle zur Produktisolierung etabliert. Darüber hinaus wurde ein Mutasyntheseansatz für die Umsetzung alternativer L-Tryptophan-Analoga zu neuen Violacein-Derivaten untersucht. Die Deletion der intrinsischen L-Tryptophan-Biosynthese und eine kontrollierte fed-batch Strategie ermöglichten die Bildung von Biomasse als Biokatalysator für die Mutasynthese, ohne eine initiale Deoxyviolacein-Produktion. Dies erlaubte das Zufüttern von synthetisierten L-Tryptophan-Analoga wie 1-Methyl-tryptophan und 7-Chloro-tryptophan. Zusammenfassend wurde ein Konzept für die effektive rekombinante Produktion von Deoxyviolacein und Derivaten davon entwickelt.

SEED FUND 3.0 Projektleiter

Marcel Schatton
IBOC - Bioorganische Chemie
HHU Düsseldorf
email: m.schatton[at]fz-juelich.de

Partner

Prof. Dr. Jaeger & Dr. Loeschcke, IMET - Molekulare Enzymtechnologie, HHU Düsseldorf
Prof. Dr. Pietruszka, IBOC - Bioorganische Chemie, HHU Düsseldorf
Prof. Dr. Wiechert & Prof. Dr. Oldiges, IBG-1 - Systembiotechnologie, Forschungszentrum Jülich

Projektlaufzeit

01.02.2022 - 30.04.2023

Förderung

Viola ist Teil des NRW-Strategieprojekts BioSC und wurde vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft des Landes Nordrhein-Westfalen gefördert.

Publikationen

Weihmann, R, Kubicki, S, Bitzenhofer, NL, Domröse, A, Bator, I, Kirschen, L-M, Kofler, F, Funk, A, Tiso, T, Blank, LM, Jaeger, K-E, Drepper, T, Thies, S and Loeschcke, A (2022). The modular pYT vector series employed for chromosomal gene integration and expression to produce carbazoles and glycolipids in P. putida. FEMS Microbes 4.