Zusammenfassung

Im OpTooGlu-Projekt war es das Ziel, neue optogenetische Werkzeuge für die lichtgesteuerte Genexpression in Gram-negativen Bakterien zu entwickeln und zu etablieren, darunter auch für die industriell sehr interessante Produktionsplattform Gluconobacter oxydans. Das oberste Ziel bestand darin, den gleichzeitigen Einsatz von UV-A- und grünlicht-aktivierbaren Effektormolekülen aus L-Arabinose und L-Rhamnose zur zweifarbigen Steuerung definierter zellulärer Funktionen in Bakterien zu etablieren, was dann zur Entwicklung neuer Strategien im Bereich der Bioprozesstechnik genutzt werden kann. Für G. oxydans wurde in einer robusten mikrofluidische Plattform die Einzelzellanalyse etabliert, die eine quantitative Bewertung von Wachstum, Morphologie und induzierbarer Genexpression ermöglicht. Die geringe Löslichkeit von UV-A-aktivierbarer L-Arabinose schränkte die Anwendung bei G. oxydans zunächst ein. Um diese Limitation zu überwinden, wurde untersucht, ob die Aufnahme von L-Arabinose bei G. oxydans gesteigert werden kann. Dies gelang schließlich durch die genomische Integration des L-Arabinose-Transportergens araE aus E. coli, wodurch die Empfindlichkeit des AraC/ParaBAD-Expressionssystems in G. oxydans deutlich erhöht wurde und nun eine effiziente und maximale Induktion auch bei ca. 500-fach niedrigeren L-Arabinose-Konzentrationen von nur 0,001 bis 0,005% (w/v) wie bei E. coli möglich ist. Darüber hinaus wurden die Systeme AraC/ParaBAD, RhaRS/PrhaBAD und RhaS/PrhaBAD in Pseudomonas putida, E. coli und G. oxydans vergleichend charakterisiert, um ihre Eignung mit lichtaktivierbaren Induktoren zu bewerten. Durch die Verwendung von E. coli LMG194 konnten die erforderlichen L-Arabinose-Konzentrationen auch gesenkt und somit die Kompatibilität mit schwer löslichen lichtaktivierbaren Verbindungen verbessert werden. Um ein alternatives, auf Blaulicht reagierendes Photorezeptorsystem zur Steuerung der ParaBAD- und PrhaBAD-abhängigen Zielgenexpression in Bakterien zu etablieren, wurde der rekombinante Photorezeptor AraBLADE in E. coli und in P. putida implementiert und erfolgreich auf das RhaS-basierte Expressionssystem übertragen, wodurch eine Blaulicht-abhängige Regulation der Genexpression für beide Spezies mit zwei orthologen Promotorsystemen ermöglicht wurde. Insgesamt wurden im Rahmen des Projekts entscheidende Fortschritte erzielt, die nun eine solide Grundlage für die künftige lichtgesteuerte Genexpression unter Verwendung von zwei Farben sowie für die Bioprozessentwicklung im Essigsäurebakterium G. oxydans und anderen Gram-negativen Bakterien bilden.

SEED FUND 3.0 Projektleiter

Dr. Tino Polen
IBG-1 - Biotechnologie
Forschungszentrum Jülich
email: t.polen[at]fz-juelich.de

Partner

Prof. Dr. Wolfgang Wiechert, Dr. Dietrich Kohlheyer, Dr. Tino Polen, IBG-1: Biotechnologie | Systembiotechnologie, Forschungszentrum Jülich
Prof. Dr. Pietruszka, IBOC - Bioorganische Chemie, HHU Düsseldorf
Prof. Dr. Thomas Drepper, IMET - Molekulare Enzymtechnologie, HHU Düsseldorf

Projektlaufzeit

01.01.2024 - 28.02.2026

Förderung

OpTooGlu ist Teil des NRW-Strategieprojekts BioSC und wurde vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft des Landes Nordrhein-Westfalen gefördert.