Zusammenfassung

Das SEED-FUND-Projekt „ProRNA“ war eine Proof-of-Concept-Studie zur mikrobiellen dsRNA-Produktion und zur Erforschung von Anwendungsmöglichkeiten von dsRNAs als neue, nicht-chemische Strategie zur praktischen Bekämpfung pflanzenparasitärer Nematoden (PPNs) mittels RNA-Interferenz (RNAi) zum Schutz von Kulturpflanzen und zur Verbesserung der Pflanzengesundheit in der Landwirtschaft und im Gartenbau. Als relevante Pflanzen-Nematoden-Pathosysteme wurden Arabidopsis thaliana und Daucus carota (Möhre) sowie die PPN-Arten Meloidogyne incognita und M. hapla als Modelle ausgewählt.
Für Meloidogyne fanden wir in der Literatur bis zu 20 dsRNAs, die hauptsächlich von M. incognita stammten und von denen berichtet wurde, dass sie in vitro über RNAi gegen M. incognita wirksam sind. Für die Mehrheit dieser dsRNAs fanden wir die entsprechenden Zielgensequenzen auch im Genom von M. hapla, was ihre allgemeine Relevanz für Meloidogyne-Arten untermauert. Die jeweiligen Genfunktionen, die die drei funktionellen Untergruppen Neuropeptide, Effektoren und Enzyme repräsentieren, die am Stoffwechsel oder an der Replikation beteiligt sind, beeinflussen die Wurzelinfektion, die Gallenbildung, die Anzahl der produzierten Eier und die Fortpflanzung.
Ausgewählte dsRNA-Sequenzen konnten erfolgreich aus Gesamt-RNA-Proben von M. hapla und M. incognita durch cDNA-Generierung und PCRs gewonnen werden, sowohl für die anschließende in-vitro-dsRNA-Produktion als auch für die Klonierung mikrobieller dsRNA-Expressionsplasmide, die für die mikrobielle in-vivo-dsRNA-Produktion verwendet wurden. Für Letzteres wurde ein Corynebacterium glutamicum-Stamm ausgewählt, der mit einem T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem ausgestattet war, und entsprechende dsRNA-Expressionsstämme wurden erfolgreich konstruiert. n-vitro-synthetisierte dsRNA-Proben und mikrobiell hergestellte dsRNA-Proben wurden erzeugt und in verschiedenen Assays getestet. In In-vitro-Einweichassays mit M. incognita waren die mRNA-Expressionsniveaus mehrerer Zielgene, insbesondere die Mi-flp18- und Mi-cpl-Niveaus, bei Nematoden, die mit der entsprechenden dsRNA behandelt wurden, stark reduziert (um bis zu 70 %), was die Funktionsfähigkeit des Einweichassay-Setups belegt und veröffentlichte dsRNA-RNAi-Ergebnisse bestätigt. In In-vitro-Infektionsassays mit M. incognita und A. thaliana konnten wir zeigen, dass Nematoden, die insbesondere in in vitro synthetisierter dsRNA eingeweicht wurden, die auf Transkripte des Neuropeptid-Gens Mi-flp18 abzielte und diese herunterregulierte, eine signifikant reduzierte Anzahl von Gallen an A. thaliana verursachten, was die zentrale Rolle des Mi-flp18-Neuropeptids unterstreicht. Um diesen regulierenden Effekt für mikrobiell produzierte dsRNA-Proben, einschließlich der gegen Mi-flp18 gerichteten dsRNA, nachzuweisen, sind weitere Untersuchungen zu den spezifischen Anforderungen an mikrobielle dsRNA-Proben, zu den Assay-Bedingungen und zur Probenanwendung erforderlich, um die RNAi-Effekte und schließlich die daraus resultierenden Auswirkungen auf das Infektionspotenzial von Meloidogyne zu analysieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass In-vitro-RNAi-Assays, In-vitro-Pflanzeninfektionsassays und eine skalierbare mikrobielle dsRNA-Produktion in vivo etabliert und optimiert wurden. Dies bildet die Grundlage für weitere Analysen zur Erforschung der Anwendungsmöglichkeiten von dsRNA-Formulierungen als neue nicht-chemische Strategie zur praktischen Bekämpfung von PPNs zum Schutz von Kulturpflanzen und zur Verbesserung der Pflanzengesundheit in der Landwirtschaft und im Gartenbau.