Foto: Forschungszentrum Jülich
Results
Ziel des Seedfund-Projekts XyloSens war die Unterstützung des HyImPAct-Projekts mit FRET-basierten Biosensoren zur kontinuierlichen nicht-invasiven Messung der C-Quellenkonzentration (D-Glucose, D-Xylose) bei Design und Prozessentwicklung neuer mikrobieller Stämme.
Ausgangspunkt der Untersuchungen war ein bereits publizierter Glukose-Biosensor, bestehend aus einem Glucose-bindenden Protein, das von zwei fluoreszierenden Proteinen flankiert wird und auf Konformations-änderungen des Bindungsproteins bei Glucosebindung mit einer veränderten FRET-Effizienz antwortet. Zu Beginn des Projekts wurde der vorhandene Glucosesensor weiter optimiert. Der Projektpartner RWTH konzentrierte sich auf den Einsatz im Mikrobioreaktor, um eine Charakterisierung von Produktionsstämmen im Hochdurchsatz zu ermöglichen. Zunächst wurden optimale Anregungs- und Emissionswellenlängen identifiziert, bei denen das stärkste und stabilste FRET-Signal aufgenommen werden kann. Weiterhin wurde die Sensorformulierung, Stabilität und Konzentration optimiert. Als Ergebnis konnte der Glucoseverbrauch einer E. coli Kultur in einem BioLector erfolgreich und reproduzierbar verfolgt werden.
Der analoge Aufbau eines Xylose-Sensors erschien aufgrund der hohen Ähnlichkeit der beiden zucker-bindenden Proteine laut Literatur nahezu trivial. Allerdings war es trotz intensiver Bemühungen noch nicht möglich, die FRET-Partner so anzuordnen, dass die Bindung von Xylose durch eine Änderung der FRET-Intensität nachweisbar gewesen wäre. Weder das Einfügen von Linkern, noch die schrittweise Verkürzung der N- und C-Termini des Xylose-bindenden Proteins führten bisher zum gewünschten Effekt. Unstrittig ist jedoch, dass unsere Xylose-Sensor-Varianten Xylose binden. Dies wurde vom Projektpartner HHU mittels Sättigungs-Transfer-Differenz-NMR (STD-NMR) eindeutig nachgewiesen.
Da die STD-NMR auch eine schwache Affinität des Glucosesensors für Xylose zeigte, wurde durch gerichtete Mutagenese die Xylose-Bindungsaffinität erhöht, was schließlich zu einem sehr schwachen FRET-Effekt gegenüber Xylose führte, während Glucose nicht mehr erkannt wurde. NMR-Studien zeigten, dass die Affinität für Xylose und Glucose unabhängig vom FRET-Ereignis erfolgreich beeinflusst werden konnte.
Prof. Martina Pohl
IBG-1 Biotechnology
Forschungszentrum Jülich GmbH (FZJ)
phone: +49 2461 614388
email: ma.pohl@fz-juelich.de
Prof. Dr. Wolfgang Wichert & Prof. Dr. Martina Pohl, IBG-1, Forschungszentrum Jülich GmbH
Prof. Dr. Dieter Willbold & Dr. Bernd König, Biophysics of Protein Interactions, Heinrich Heine University Düsseldorf
Prof. Dr. Jochen Büchs, Biochemical Engineering, RWTH Aachen University
01.10.2018 - 31.03.2021
XyloSenS ist Teil des NRW-Strategieprojekts BioSC und wurde vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft des Landes Nordrhein-Westfalen gefördert.
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